一、介绍

自光学显微镜发明以来，研究人员一直在努力提高目标信号相对于背景噪声的影响。荧光团因其亮度、明确的激发和发射、重复性和在生物系统中的易用性而成为主流的信号产生标记物。然而，使用荧光团也引入了一定的局限性。由于光子的基本物理特性，衍射极限以下的特征无法分辨。此外，单一甚至成簇的荧光团在背景下很难用传统的荧光显微镜分辨出来。因此，衍射和背景信号是单分子荧光检测的主要依据。

成功克服光的衍射极限的各种方法统称为超分辨显微镜。在过去的几十年里，随着仪器、光学、荧光团化学（自发荧光染料）和成像后计算处理的变革性进步，超分辨显微镜得到了深刻的改进。荧光团信噪比的改善主要依赖于先进的成像装置，如全内反射荧光(TIRF)显微镜，其中产生的消逝波仅在界面附近激发荧光团或共焦显微镜，利用针孔来阻挡来自探测器的失焦光。而在过去的几十年里，研究实验室不得不手工构建单分子检测系统越来越多的商业统包解决方案。尽管取得了这些进展，但许多研究实验室无法获得专门的单分子设备。荧光显微镜是细胞生物学和免疫荧光成像的主要设备。由于超荧光显微镜在信号分辨方面还没有得到优化，因此要分辨单个分子，就需要一种明亮的荧光共轭物。

二、实验结果

1.玻璃表面荧光测量

作者测试了SA-PE偶联物是否可以在“类似TIRF”的表面检测试验中发挥作用，其中荧光分子将定位到玻璃界面并成像。TIRF显微镜通过只照亮靠近光界面的薄样品层来降低背景强度。相比之下，表观荧光显微镜从整个样品中收集光，遮蔽了单个的荧光团。因此，当使用表观荧光显微镜时，需要一个明亮的荧光共轭物来提高信号在背景之上。首先，在玻璃表面钝化前将生物素化牛血清蛋白(BSA-bt)沉积在玻璃上。然后我们分别添加SA-PE共轭物来检测固定化BSA（图 1a）。能够在玻璃表面分解单个SA-PE共轭物(图1B)。得出结论， 这些SA-PE偶联物成功地提供了可分辨的单分子信号。 为了测试是否能列举出玻璃表面上的一种分析物的已知数量，作者准备了一种单分子计数试验(图2A)。选择了荧光虽然不像其他共轭物那么亮，但低背景表面结合的SA-PE（PJRS27）(图S2A和B)。链霉亲和素在96孔板中孵育，以非特异性地粘附在表面。使用的生物素化小鼠单克隆抗体(mAb-bt)作为分析物。mAb-bt在起始浓度为500 pM和经过两倍连续稀释至7.8 pM时进行测量(图2B)。观察到病灶数目与mAb-Bt分析物浓度之间的线性相关关系（图 2c）。有限的非特异性背景结合使SA-PE结合物的灵敏度低于20pm，证明SA-PE可以用于表面分析物的检测和定量。

2.单分子诊断学

首先在一个检测相同生物素化抗体（mAb-Bt）的模型试验中测 试荧光信号 图 2 (图 3a）。用山羊抗鼠抗体包被磁性微粒，并用一系 列飞摩浓度的mAb-Bt包裹磁性微粒。微球洗涤，与SA-PE结合物孵育， 再次洗涤，转移到玻璃底板上成像。我们在微粒上清楚地看到了单独的SA-PE结合（图 3b）。同样，亮的三个SA-PE共轭物--PJRS20、 PJRS34和PJRS301--产生了高的信号（图 3C、图 S3)。中等亮度的共轭物PJRS25和PJRS27，在微粒上都是可见的，但暗淡的PJ39S几乎无 法分辨（图S3)。6种SA-PE偶联物中的4种与识别的靶点和mAb-bt浓度呈线性相关，PJ39S和PJRS27都太暗淡，无法精确量化。亮的三种SA-PE偶联物之间的差异不影响该方法的检测灵敏度，所有方法的低端灵敏度极限均为~15 fM(图3C，图S3)。因此，我们表明SA-PE共轭物可以用于模型诊断试验中的基于数字的检测。

初筛选的亮的三种SA-PE共轭物，用于与微粒的非特异性结合。PJRS20表现出显著的非特异性结合，而PJRS301表现出更好的性能，被选择用于分析物检测(图S4)。再一次，我们清楚地能够解决微粒上的单个病灶，这些微粒对HBsAg的稀释有剂量反应（图 4b）该数字分析法显示HBsAg的灵敏度极限为4.1 mIU mL−1，与商业化学发光法相比，灵敏度提高了约5倍(图4C)。因此，表明商用SA-PE共轭物可用于临床相关分析物的敏感检测。

3.单分子细胞表面成像

在培养的HEK293细胞上测试了进化保守且广泛表达的细胞表面蛋白β -连环蛋白(Beta-catenin)，用于单分子成像。β-连环蛋白是粘附结的结构成分，也是Wnt信号转导通路的效应因子。用结合AlexaFluor594的抗兔抗体进行免疫荧光成像，证实β -catenin在表面表达(图S5)。由于β-连环蛋白高度表达，我们滴定抗-连环蛋白一抗抗体浓度低于标准免疫荧光方案。可以清楚地看到HEK293细胞膜上明显的SA-PE病灶(图5A)。

选择单焦点并与高斯函数拟合，确定为单点源(图5B)。忽略一抗的对照实验仍然有可见和可量化的病灶，这表明细胞表面存在SA-PE的非特异性吸附。在10 ng mL−1的一抗和SA-PE存在的情况下，平均每100 μm2有3.8个病灶，单用SA-PE每100微米2有1.4个病灶（图 5c）。在不添加SA-PE的固定细胞上，每100μm 2仅能识别出0.1个病灶。当一抗浓度超过10 ng/ ml时， 可导致病灶荧光重叠和可分辨病灶减少。因此，我们检查带有0或10 ng /ml一抗的细胞的分布，并用高斯函数拟合扩展（图 5d）。在每 100μm有2～3个病灶2的区域内，两个种群有一定的重叠。因此，单个 细胞不能被准确地分配到任何一种情况，但群体水平的分析确实表明不同的分布。因此，SA-PE的单分子成像最适合于两个群体的半定量或二元分析。

三、结论

到目前为止，商用SA-PE已用于检测平均测量，如流式细胞术。本篇文章中表明SA-PE可以转化为数字检测的用途。为研究人员提供了一个更容易适应的单分子计数框架。基于生物素-链霉亲和素相互作用，提供了一个广泛的分析物检测“通用”平台。这种技术可以通过使用与检测抗体 （如抗FLAG）复合的其他藻胆蛋白来进一步复合。

参考文献：Epifluorescent single-molecule counting with Streptavidin-Phycoerythrin conjugates.